摘要：(    摘  要  以成熟苹果果实的RNA为模板，经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶（APPO）长度为710bp的反义、正义基因片段。以副球菌中类胡萝卜素合成有关的（crtW+crtY）融合基因片段YYT为间隔区，将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联，将构成全长为2444bp的DNA插入到植物双元载体pYPX145中，构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草核基质结合区(SAR)序列，利于转基因的稳定遗传。以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士，通过50mg/L卡那霉素筛选和GUS检测，获得了转基因植株。通过荧光定量RT-PCR检测，结果显示转基因苹果植株内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69%以上，研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。 
    关键词  双链RNAi; 苹果多酚氧化酶; 载体构建; 苹果

RESEARCH ON APPLE POLYPHENOL OXIDASE DOUBLE-STRANDED RNA(RNAi)

Cao Yanhong1,2)  Zhang Zhen1)  Yao Quanhong2)  Peng Rihe2)  
Xiong Aisheng2)   Li Xian2)
 (1)Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;
 2) Shanghai Key Laboratory of Genetics and Breeding, Agri-biotechnology Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106)

    Abstract   Antisense and sense gene fragments (710 base pairs) of apple polyphenol oxidase (APPO) gene were obtained by RT-PCR amplification, using the total RNAs isolated from ripen apple fruit as the template. These two fragments were ligated by a 1000bp spacer, YYT(crtW+crtY fusion ) gene, which is relative to carotenoid synthesization in subcocci. The full-length 2444bp-target gene was then inserted into plant binary vector pYPX145 to generate the recombinant plasmid pYF7704, which carried the expression unit of APPO dsRNA. The characteristic of the vector is that at both ends of the target gene there is a SAR sequence, which is beneficial to the stable heredity of the transgene. pYF7704 was transformed to apple (Malus domestica) var. Red Fuji via Agrobacterium tumefaciens mediated leaf disc transformation. With the selection of Karamycin and GUS detection assays, transgenic plants of APPO dsRNA were obtained. The results of FQ-RT-PCR indicated that APPO mRNA level was supressed to 91.69% in transgenic plants compared to wide plants. The data suggested that dsRNA technology on the apple polyphenol oxidase is feasible to be utilized in transgenic plants.
    Key words  Double-stranded RNA; Polyphenol oxidase (PPO); Vector construction; Apple (Malus domestica)